Dna recombinant

Pada umumnya bakteri mempunyai satu kromosom. Kromosom bakteri berupa DNA sirkular atau DNA yang berbentuk lingkaran. Disamping memiliki satu kromosom, berbagai jenis bakteri juga memiliki DNA sirkular lainnya yang ukurannya jauh lebih kecil dari pada DNA kromosomnya. DNA sirkuler selain kromosom yang terdapat pada bakteri dinamakan plasmid. Jadi, plasmid merupakan DNA bakteri yang terpisah dari kromosom bakteri. Plasmid dapat bereplikasi sendiri. Plasmid juga mengandung berbagai gen. Jenis, jumlah jenis, dan jumlah tiap jenis ( copy ) plasmid bervariasi antar sel. Bahkan antar sel dalam satu spesies bakteri.

Plasmid mulai digunakan sebagai vektor untuk mengklonkan gen. Dalam hal ini, plasmid digunakan sebagai pembawa fragmen DNA asing. Dengan kata lain, plasmid dikombinasikan dengan DNA asing. Plasmid rekombinan yang pertama kali berhasil bereplikasi di dalam sel bakteri adalah plasmid pSC101 yang telah dikonstruksi oleh Stanley Cohen dan Herbert Boyer (SC= Stanley Cohen)

Salah satu contoh plasmid yang telah lama digunakan sebagai vektor untuk mengklon gen adalah plasmid pBR322. Plasmid pBR322 ini mengandung gen penyandi resistensi terhadap ampisilin dan tetrasiklin. berbagai sisi yang dapat dipotong oleh enzim restriksi. Adanya gen resistensi terhadap antibiotik yang didalamnya mengandung situs enzim restriksi akan memberikan kemudahan dalam menyeleksi plamid rekombinan atau memudahkan dalam menyeleksi klon bakteri yang telah membawa plasmid rekombinan. Akan lebih memudahkan lagi dengan adanya enzim yang hanya memotong pada bagian gen resistensi terhadap antibiotik. Misalnya, enzim Pst I yang hanya akan memotong pBR322 pada bagian gen resistensi terhadap ampisilin ( gen Ap R). Demikian pula dengan enzim Bam HI yang akan memotong plasmid pBR322 pada bagian gen resistensi terhadap tetrasiklin (gen Tet R).

Beberapa tahap untuk mengklonkan gen atau fragmen DNA Dari beberapa perangkat diatas (enzim restriksi, enzim DNA ligase, dan plasmid), telah memungkinkan bagi kita untuk mengklonkan gen atau fragmen DNA. Dalam hal ini, kita dapat membuat plasmid rekombinan (plasmid yang mengandung fragmen DNA asing) di dalam tabung reaksi. Bila dikombinasikan dengan salah satu cara bakteri memindahkan DNA, yaitu transformasi, kita dapat memasukkan plasmid rekombinan tersebut ke dalam sel bakteri. Tahapan utama untuk mengklonkan gen atau fragmen DNA adalah sebagai berikut: Pemotongan plasmid. Menyisipkan gen atau fragmen DNA. Memasukkan DNA kedalam sel bakteri (trasformasi). Seleksi klon bakteri yang benar yaitu bakteri yang mengandung plasmid rekombinan

Pemotongan plasmid.

Plasmid pBR322 dipotong di dalam tabung reaksi menggunakan enzim Pst I maka pBR322 akan terpotong pada bagian gen Ap R.

Menyisipkan gen atau fragmen DNA

. Bila pBR322 yang sudah terbuka lingkarannya dicampur dengan potongan DNA asing dan kemudian ditambahkan enzim DNA ligase, maka kemungkinan hasilnya adalah berupa campuran yang berisi: 1) plasmid pBR322 yang tersambung kembali atau membentuk lingkaran lagi seperti semula,dan 2) plasmid rekombinan yaitu pBR322 yang telah disisipi oleh DNA asing.

Memasukkan DNA kedalan sel bakteri (Trasformasi).

Campuran kedua bentuk plasmid ini kemudian dicampurkan dengan kumpulan sel bakteri hidup yang tidak mempunyai plasmid. Kemungkinan hasilnya berupa campuran yang berisi:

1) sel bakteri yang mengandung plasmid pBR322 tanpa sisipan.

2) sel yang mendapatkan plasmid rekombinan (pBR322 yang telah disisipi DNA asing).

3) sel bakteri yang tidak mengandung (tidak dimasuki) plasmid. Contoh plasmid lainnya yang telah lama digunakan sebagai vektor untuk mengklonkan gen adalah plasmid pUC118 dan pUC119. Plasmid ini merupakan pengembangan dari pBR322. Plasmid pUC118 dan pUC119 mengandung gen lac Z yang menyandikan enzim ß -galactosidase. Enzim ß -galactosidase akan memecah Xgal menjadi galaktosa dan 5-bromo-4-chloroindigo (biru). Oleh karena itu koloni bakteri yang mengandung plasmid pUC118 atau pUC119 akan berwarna biru bila ditumbuhkan pada media yang mengandung Xgal. Pada lac Z terdapat daerah yang disebut daerah polikloning. Pada daerah polikloning ini terdapat banyak situs restriksi dari berbagai enzim restriksi. Dalam hal ini, kita dapat menggunakan berbagai enzim restriksi untuk memotong pUC118 atau pUC119 pada bagian lac Z. Dengan demikian kita dapat menyisipkan DNA asing pada bagian lac Z. Bila gen lac Z disisipi oleh DNA asing maka gen lac Z tersebut tidak berfungsi (tidak menghasilkan ß -galactosidase). Bila kita menggunakan pUC118 atau pUC119 sebagai plasmid vektor, maka koloni yang membawa plasmid rekombinan dapat dideteksi dengan menggunakan media tumbuh yang mengandung Xgal (5-bromo- 4-chloro-indolyl-b-D-galactoside). Koloni bakteri yang mengandung plasmid pUC118 atau pUC119 akan berwarna biru karena ada gen lac Z yang menghasilkan ß - galactosidase. Enzim ß -galactosidase memecah Xgal menjadi galaktosa dan 5-bromo-4-chloroindigo yang berwarna biru. Koloni bakteri akan berwarna putih bila pUC118 atau pUC119 telah disisipi DNA asing pada bagian lac Z. Dalam hal ini gen lac Z tidak berfungsi karena disisipi DNA asing. Jadi, koloni yang mengandung plasmid rekombinan adalah koloni yang berwarna putih