Prosedur Pembuatan Poly-L Lysine Coating Slides

Poly L Lisine : merupakan suatu metode yang digunakan sebagai adhesiv (perekat) dalam proses persiapan histologis. Metode ini merupakan metode untuk melapisi glass microscope slide (object glass), pelapisan ini berfungsi untuk mengikat DNA probe yang rusak pada slide dan mencegah ikatan non spesifik (reaksi) silang  yang mungkin terjadi selama proses hibridisasi.

Prosedur Pembuatan Poly-L Lysine Coating Slides

Place glass slides into glass bottomless slide racks and place in a beaker

Letakkan slide (objek glass) pada slide racks dan letakkan pada beaker

Add an appropriate volume of 1M HCl (enough to cover the racks)

1M HCl = 86.2 ml in 1 liter

Tambahkan secukupnya 1M HCL (pokoknya hingga melapisi slide racks)

Boil for 10 minutes

Rebus selama 10 menit

Place beaker under steady stream of water until the slides are completely rinsed

Letakkan beaker pada aliran air yang tidak terlalu deras hingga slide tersebut terbilas secara sempurna

Dip each rack (1 at a time) into the poly-L lysine solution in a glass bowl for 10 minutes (400 ml)

Poly-L lysine solution:  50 mg/ml in 10 mM Tris pH 8 (0.02 g Poly-L lysine in 396 ml water and 4 ml 1M Tris  pH 8)

Celupkan setiap slide rack kedalam larutan poly-l-lysine dalam bowl glass selama 10 menit

Larutan Poly-l-lisine : 0.02 g Poly-L lysine dalam 396 ml water dan tambahkan 4 ml 1M Tris  pH 8

Let slides dry on bench (make sure they are covered so nothing sticks to them)

Place sides in a clean, covered slide rack

Biarkan slide kering dan pastikan telah terlapisi secara rata, kemudian letakkan slide pada tempat yang bersih dan tutupi slide rack

·         Prosedur Penggunaan Poly-l-lisine coated glass

Alat dan bahan :

Slide staining rack

Slide staining through

Hotplate

UV crosslinker

Succinic anhydride

1-methyl-2-pyrrolidinone

Boric Acid

MilliQ Water

Orbital shaker (dalam fume hood)

Microwave oven

Hettich Rotina 35 microtiter plate

Microscope slide box

Horizontal laminar flow work station

96% ethanol

1.      Panaskan poli-l-lisine slide pada hotplate selama 15 menit pada suhu 80C. Kemudian dilakukan penyinaran dengan sinar UV dengan menggunakan UV crosslinker. Stelah itu letakkan slide pada staining rack dan letakkan setiap rak pada slide staining through

2.      Membuat blocking solution. Proses ini harus dilakukan pada fume hood

3.      Celup-celupkan slide pada blocking solution (5-10x) dan kemudian biarkan didalam larutan selama 20 menit pada orbital shaker

4.      Celupkan-celupkan kedalam 95C ddH2O selama 2 menit. Ketika reaksi telah berhenti ditandai dengan tidak adanya gelembung, masukkan slide ke dalam air. Proses ini akan merusak (membuka) double strand DNA

5.      Masukkan slide ke dalam ethanol 96% selama 1 menit kemudian letakkan pada laminar flow workstation. Kemudian masukkan slide kedalam microscope slide box. Dan kemudian dilakukan sentrifuse selama 5 menit pada 650rpm dengan menggunakan microtitre plate centrifuge. Slide dapat segera digunakan untuk reaksi hibridisasi atau disimpan pada tempat yang dingin,kering dan steril.