Isolasi DNA

Isolasi DNA merupakan tahap pertama dari berbagai teknologi analisis DNA DNA dapat ditemukan baik pada kromosom inti maupun pada organel yaitu pada mitokondria dan kloroplas. Untuk mengekstrak DNA diperlukan langkah-langkah laboratorium untuk memecahkan dinding sel dan membran inti, dan dilanjutkan dengan pemisahan DNA dari berbagai komponen sel yang lain.  Pada saat melakukannya harus dijaga agar DNA tidak rusak dan didapatkan DNA dalam bentuk rantai yang panjang.

          Proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak.  Untuk membantu terjadinya lisis biasanya dilakukan inkubasi pada suhu sekitar 60^oC.  Dalam proses ini  biasa digunakan senyawa senyawa phenol, chloroform dan isoamyl alcohol untuk memaksimalkan proses lisis.

          Proses selanjutnya adalah pemisahan DNA dari komponen sel yang lain atau kontaminan yang tidak diinginkan.  Pemisahan DNA dari komponen sel yang lain, termasuk debris sel, dilakukan dengan sentrifugasi.

          Kontaminan yang umum ditemukan adalah polisakarida yang dapat mengganggu proses PCR dengan cara menghambat aktivitas Taq polymerase, atau poliphenol yang dalam bentuk teroksidasi akan mengikat DNA secara kovalen.  Untuk menghindarkan hal ini jaringan yang digunakan dijaga tetap dingin sebelum dan selama proses ekstraksi.  Selain itu dilakukan penambahan antioksidan seperti PVP.

          Setelah dilakukan ekstraksi dilakukan presipitasi DNA dengan menggunakan ethanol atau isopropanol.  Selain DNA semua bahan yang lain kan larut dalam ethanol dingin. Sehingga saat dilakukan sentrifugasi DNA akan mengendap dan terpisah dari senyawa-senyawa/bahan  lain.

Sebagai bahan untuk  RFLP harus digunakan DNA yang bersih dari kontaminan (mempunyai kemurnian tinggi) dan dengan berat molekul yang tinggi.  Selama proses ekstraksi DNA beberapa hal yang dapat terjadi adalah :

-          DNA patah-patah selama proses isolasi

-          DNA terdegradasi oleh enzim nuclease

-          Terjadi kontaminasi oleh polisakarida

-          Metabolit sekunder ikut terisolasi