Penggunaan Enzym HindIII dalam Kloning Gen Penisilin V Asilase dari Bacillus sp BAC4 Melalui Pembuatan Pustaka Genom

Antibiotik penisilin pada awalnya digunakan untuk mengobati penyakit infeksi yang banyak terjadi pada saat perang dunia kedua. Namun beberapa tahun kemudian, pengobatan penyakit infeksi dengan antibiotik ini tidak efisien lagi, karena banyak mikroorganisme telah menjadi resisten. Oleh karena itu, dengan perkembangan ilmu pengetahuan, dikembangkan antibiotik-antibiotik baru melalui modifikasi struktur penisilin agar efektifitas antibiotik ini dapat diperoleh kembali. Berbagai turunan penisilin telah dibuat dan digunakan. Dalam proses pembuatan turunan antibiotik, banyak dilibatkan gen pengkode enzim enzim tertentu, contohnya gen penisilin V asilase (PVA) yang banyak ditemukan pada bakteri dan jamur. Enzim ini merupakan kunci dalam pembuatan antibiotik β-laktam semisintetik karena dapat menghidrolisis penisilin V untuk menghasilkan senyawa antara yaitu asam 6-amino penisilanat (6-APA), suatu senyawa antara untuk memproduksi penisilin semisintetik, diantaranya metilsilin, kloksasilin, ampisilin dan karbenisilin. Peningkatan produksi enzim PVA banyak dilakukan melalui pendekatan genetik, yaitu dengan memindahkan gen pengkode PVA ke dalam suatu sel inang yang dapat mengekspresikan gen tersebut dengan aktivitas tinggi. Kloning gen yang mengkode PVA dari Bacillus sphaericus dan ekspresinya dalam Escherichia coli dan Bacillus subtilis telah diteliti . Strain lokal Bacillus sp. BAC4 selain memproduksi penisilin G asilase (PGA) juga menghasilkan PVA

Pustaka genom (genomic library) adalah kumpulan klon rekombinan dalam bentuk plasmid, phage atau kosmid yang membawa fragmen molekul DNA tertentu secara independen, berukuran tertentu dan merupakan kumpulan keseluruhan informasi genetik suatu organisme. Pustaka genom dapat dibuat dengan memurnikan DNA kromosom dan memotong DNA tersebut secara parsial dengan enzim restriksi tertentu, baik melalui variasi konsentrasi enzim maupun variasi waktu inkubasi. Fragmen tersebut diharapkan mewakili keseluruhan gen pada suatu organisme. Selanjutnya fragmen DNA diinsersikan ke vektor yang sesuai sehingga dihasilkan vektor rekombinan. Hasil pengemasan (packing) dapat ditransfeksi ke dalam sel inang yang sesuai, sedangkan bila menggunakan vektor plasmid, hanya dilakukan transformasi dengan metode kejutan panas (heat shock) ke dalam sel inang. Dalam penelitian ini, gen PVA dari Bacillus sp. BAC4 akan diklon ke dalam vektor plasmid menggunakan pustaka genom. Pustaka genom dibuat dengan memurnikan DNA kromosom Bacillus sp. BAC4 dan memotong DNA tersebut secara parsial dengan enzim restriksi tertentu melalui variasi konsentrasi enzim. Fragmen tersebut diharapkan mewakili seluruh gen yang terdapat pada suatu organisme. Selanjutnya fragmen DNA diinsersikan ke vektor yang sesuai sehingga menghasilkan vektor rekombinan. Hasil pengemasan (packing) ditransfeksi ke dalam sel inang yaitu E. coli. Ekspresi skrining dilakukan untuk melihat aktivitas PVA klon rekombinan. 

Pemotongan DNA plasmid, DNA asing, dan DNA rekombinan dilakukan menggunakan enzim restriksi tertentu. Enzim restriksi yang dipergunakan adalah enzim HindIII untuk memotong DNA plasmid dan DNA asing. Hasil pemotongan DNA dengan enzim restriksi diamati dengan elektroforesis gel agarosa. Visualisasi DNA genom Bacillus sp. BAC4 dalam 0,8% gel agarosa tampak sebagai satu larik dengan ukuran lebih dari 23 kb dengan marker DNA λ/HindIII. Sedangkan hasil analisis DNA plasmid pHB201 menunjukkan adanya berbagai bentuk konformasi DNA plasmid.  Ukuran DNA plasmid tersebut tidak dapat dibandingkan dengan standar I karena konformasi molekulnya berbeda. DNA λ/HindIII memiliki konformasi linier, sedangkan DNA plasmid memiliki konformasi covalently closed circular (ccc). Oleh karena itu DNA plasmid perlu dipotong menggunakan enzim restriksi tertentu sehingga konformasinya menjadi linier dan dapat dibandingkan dengan marker DNA λ/HindIII. Pemotongan DNA kromosom dan DNA plasmid pHB201 hasil isolasi dilakukan dengan enzim restriksi HindIII. Enzim ini disolasi dari Haemophilus influenze Rd dan mempunyai urutan pengenal AAGCTT. Pemotongan DNA kromosom dan DNA plasmid dengan enzim HindIII akan menghasilkan ujung lengket AGCT. DNA kromosom Bacillus sp BAC4 dan pemotongan DNA kromosom hasil isolasi dengan enzim restriksi HindIII menghasilkan fragmen yang berukuran lebih besar dari 23 kb dengan tingkat kemurnian 1,3. DNA plasmid yang diisolasi dari bakteri E. coli dan pemotongan DNA plasmid hasil isolasi dengan enzim restriksi HindIII menghasilkan fragmen berukuran 6,5 kb. Plasmid rekombinan hasil ligasi digunakan untuk mentransformasi sel inang E. coli JM109.