RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

Marka molekuler RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) merupakan marka molekuler yang menggunakan enzim restriksi dalam mengidentifikasi sekuensi-sekuensi DNA suatu individu. Enzim restriksi ini berperan memotong rangkaian DNA genom individu menjadi potongan-potongan yang berbeda-beda ukurannya dan menjadi sumber informasi genetik spesifik dalam mendeteksi variasi sekuensi DNA yang dimiliki suatu individu.

Analisis RFLP yang merupakan marker ko-dominan telah banyak digunakan untuk mencapai berbagai tujuan. Mengingat situs restriksi mempunyai sekuensi DNA tertentu, berarti variasi keberadaan situs restriksi mencerminkan adanya variasi sekuensi DNA. Dengan kata lain, RFLP dapat berfungsi sebagai penduga variasi DNA. Penggunaan fragmen restriksi sebagai marker genetik telah didemontrasikan sejak tahun 1974 oleh Grodziker et al., (1974). Dalam studinya, karakter sensitif suhu dari organisme adenovirus berhasil dipetakan dengan menggunakan fragmen restriksi (marker RFLP). Sejak itu, banyak studi telah dilakukan untuk mengembangkan peta keterkaitan (linkage map) dan pembuatan peta genetik berbagai penyakit turunan pada manusia. Untuk individu, analisis keterkaitan dari marker RFLP telah berhasil dilakukan untuk individu jagung, tomat, kacang kapri dan lain-lain

Berbagai penerapan marker RFLP tersebut antara lain : (1) menduga hubungan kekerabatan dari beberapa individu yang dianalisis, (2) menduga ada tidaknya variasi genetik dari koleksi plama nutfah,(3) memonitor kemurnian benih hibrida, (4) memonitor proses seleksi (melalui linkage) berbagai karakter agronomis penting, (5) memilah-milah komponen genetik dari karakter kuantitatif, (6) menganalisis gen yang berasal dari proses transformasi genetik. Dalam hal ini, posisi integrasi dari gen tersebut dalam kromosom individu resipiennya akan dapat ditentukan.

Teknik ini menggunakan enzim-enzim restriksi yang berfungsi sebagai pemotong DNA rantai ganda pada sekuens yang  spesifik, untuk menentukan apakah dua fragmen DNA memiliki  kesamaan. Dalam teknik ini, DNA didigesti atau dipotong de ngan enzim restriksi tertentu, kemudian dielektroforesis pada gel agarose yang akan memisahkan fragmen DNA yang dipotong  sesuai dengan ukurannya. Kalau DNA tidak identik ukurannya, maka pola fragmen DNA pada gel tidak akan sepadan. Bila pola  fragmen DNA sarna, maka enzirn restriksi tersebut akan digunakan untuk menentukan apakah dua rantai DNA merniliki kesamaan. Satu rantai DNA yang tidak diketahui dapat diidentifikasi  apakah berasal dari agen penyakit tertentu atau tidak dengan cara pembar pola RFLP dengan referensi standar.

Dalam analisis RFLP, genomik DNA yang dipotong dengan enzim restriksi dipisahkan melalui gel elektroforesis, dan diblot ke membrane netroselulase. Dasar dari transfer DNA dari gel ke pensupport yang lebih solid adalah untuk mengawetkan posisi fragmen DNA dan menyebabkan hibridisasi dapat dilakukan. Pola banding yang spesifik divisualisasi dengan hibridisasi dengan probe yang dilabel. Probe biasanya probe lokus tunggal yang spesies-specific berukuran 0.5 – 3kb yang diperoleh dari cDNA library atau genomik library.